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年，受秀吉之命，再次從屬德川家。以後參加了九州討伐與小田原之戰。慶長五年(1600)，秀吉死後，參加了家康對上杉的會津合戰。不久石田三成等舉兵對抗家康，並給昌幸送了密信。昌幸父子在下野的犬伏密談後，昌幸與二子幸村加入了石田方的西軍，(昌幸之妻是石田三成的妻子的妹妹，幸村的妻子是大谷吉繼的女兒)。而長子信幸由於娶了本多忠勝的女兒小松而加入了德川方的東軍。兩個月後，昌幸又是在上田城，以三千兵將德川秀忠的數萬東軍牢牢的釘在了信濃，使之沒能趕上關原之戰。西軍失敗後，昌幸、幸村父子因信幸的原因沒有遭處死，被流放到九度山。關原之戰的十一年後，也就是慶長十六年六月四日(1611年7月13日)，真田昌幸在極度失望中去世，行年六十四，法號龍華院殿一翁閒雪。據說死前經常只與幸村兩人在一起，長時間地說著話。

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