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後醍醐天皇重新即位後，改元&ldo;建武&rdo;，實施新政。任命高階貴族任中央各機構的大臣以及地方的國司，並強化天皇本人的許可權。一方面否定對天皇行使權利構成威脅的幕府、院政、攝政、關白等機構或職務，另一方面，廢除知行國制度，土地所有權的證書均由後醍醐天皇親手寫成。中央機構設有處理重要政務的記錄所、處理訴訟的雜訴決斷所、統率軍隊的武者所、掌管獎賞的恩賞方等機構；地方機構每國均設守護、國司，同時設鎌倉將軍、陸奧將軍，由後醍醐天皇的兩個兒子擔任其職。

後醍醐天皇實施的新政不到三年就結束了，其原因首先是權力過於集中，賞賜不均。重要政務完全由天皇本人決定，親自簽發土地所有權證書，難以做到客觀公正。甚至其子護良親王任徵夷大將軍也受到天皇的排擠，最後只好流落地方並被殺；其次是難以協調討幕各派之間的矛盾。公家希望恢復貴族政治，武士希望恢復武家政治，傳統勢力要求復古，新興勢力要求革新，沒有強大武力做後盾的後醍醐天皇難以平衡各派的利益衝突；另外，在百廢待興之際，朝廷還大興土木，修建宮殿，並為此發行大量貨幣，增加稅收，結果引起各界的不滿；最重要的是，在進入武家時代以後，難以恢復律令時代的天皇政治結構。雖然鎌倉幕府倒臺，但武士的力量反而有所增強，他們對天皇朝廷未滿足其要求而心懷怨言。尤其是作為武士領袖的足利高氏，因倒幕有功而被賜後醍醐天皇名字中的&ldo;尊&rdo;而稱足利尊氏，但仍受到冷遇。

年，北條家族的旁支北條時行在關東地區起兵並佔領鎌倉，足利尊氏要求率軍東徵，並要求得到徵夷大將軍的稱號，但遭到後醍醐天皇的拒絕。足利擅自率軍出京都，並打敗北條時行，奪回鎌倉，同時明確表示反對朝廷。後醍醐天皇派遣新田義貞攻打足利，但被打敗。1336年，足利被北畠顯家打敗，流落九州地區，但在各地武士的支援下，打敗楠木正成，重新佔領京都。足利廢后醍醐天皇，擁立持明院系的光明天皇，並頒布了顯示其執政方針的《建武式目》，內容包括禁奢侈，行儉約；鎮暴行，止賄賂；戒官員緩怠，選賢者為吏；京中空地歸還原主；受理貧弱之輩的訴訟；興辦專營金融借貸的土倉；委任忠誠足利氏的有軍功者、有才幹者為守護等，並在此基礎上正式建立幕府。1338年，足利尊氏在又從光明天皇那裡得到&ldo;徵夷大將軍&rdo;的稱號。

年，被廢黜的後醍醐天皇在同年底逃出京都，在京都南部吉野山組成另外一個朝廷，形成南北朝局面。最初兩年尚有所對抗，但1339年後醍醐天皇去世，支援南朝的北畠顯家、新田義貞等也相繼戰死，南朝已經沒有實力與北朝對抗。但偏居一隅又缺乏武力的南部朝廷之所以能夠經歷四代天皇並堅持了57年時間，是因為室町幕府內部足利兄弟爭權奪利的結果。

幕府成立之初，將軍足利尊氏作為最高的統治者執掌恩賜、軍事大權，其弟足利直義行使政務實權，但兩人因統治理念的差異而發生衝突。即前者藐視傳統權威並急於建立全國性政權，而後者主張尊重傳統權威並漸進統一。兩者的衝突後來發展成全國性的動亂，並輪流與南朝合作。首先是在1350年足利直義轉向南朝，打敗北朝軍隊後兄弟和好，但足利尊氏在取得南朝天皇的支援後，消滅了足利直義。其後，尊氏重新扶植北朝，而且幕府統治也逐漸穩定。直到第三代將軍足利義滿1368年執政後，採取各種措施成功地削弱了稱霸一方的守護權力，進一步鞏固了幕府的統治基礎。1392年，足利義滿呼籲南北朝統一，並得到南朝的積極反應，南朝後龜山天皇回到京都，並將象徵天皇權威的三件神器交給北朝的後小松天皇，長達半個多世紀的南北朝對立基本結束。

二、 室町幕府